超聲波法破碎細胞的常見問題

超聲波法破碎細胞的常見問題分析如下

問題：大腸杆菌表達外源蛋白，在超聲破碎的時候，用含有1%triton-X-100的PBS懸浮，然後超聲的效果較好，1%triton-X-100的作用還是很明顯的，對其他的一些**同樣起作用，比如鏈黴菌。在表達重組蛋白後超聲波破碎細胞，采用冰浴，400w，破碎2s停1s，但是不一會就產生大量泡沫，影響了破碎功率，pbs和tris緩衝液都是這樣，*後都是破碎不完全，而目的蛋白就在這些未破碎的細胞中，怎麼辦？

解析：（1）會產生氣泡是因為探頭位置冇放好。

     （2）探頭一定要接近底部，約0.5-1cm。

     （3）功率根據儀器不同會有所不同，但可以觀察液麵，有波動但不要太劇烈。

     （4）可以選擇破碎3s停10s，破碎20-30次。

     （5）變幅杆位置擺放也要注意，聽聲音如果不對的話就要及時調整。

     （6）從菌濃度方麵考慮。在破碎時試著加大體積，強度*好不要超過60%。

     （7）嘗試破碎8s停8s，對有些菌體蛋白來說，難散熱導致蛋白變性產生氣泡，可以停頓時間稍長一些，這種情況多見於包涵體形式的蛋白。

問題：鏈黴菌（放線菌）超聲破碎條件是什麼？

解析：放線菌屬於原核生物係統進化樹上的（G＋C）摩爾百分含量（mol％）高的革蘭氏陽性菌（Eubacteria）分枝類群，它雖然具有原核生物特有的分子生物學特性，但在其不同類群中，細胞壁的化學組分變化很大。在做大腸杆菌超聲時，采用的是400W，破碎5s停5s的方法，效果不錯，但是用在鏈黴菌上，由於細胞壁組成差異一般冇什麼效果。

鏈黴菌（放線菌）超聲破碎前處理一般是配置成一定濃度的菌懸液。使用超聲破碎時采用的具體條件是：
    (1)取**的24h培養液於5 000 r／min 下離心5 min收集菌體。

(2)用pH 7．5的Na2HPO -NaH2PO緩衝液洗滌3次，再用該緩衝液將菌體配成1：3的菌懸液。置於40 mL大塑料試管內。

(3)將大塑料試管置於冰浴中，采用超聲波破碎(功率200W，1／2”探頭，破碎30s，間歇30s)。

(4)破碎液於12 000 r／min下高速冷凍離心30min，收集細胞碎片和上清夜。洗滌菌體也可以用預冷的生理鹽水或pH8的Tris－HCl，洗滌一次就可以。另外，超聲劑量隨樣品量、菌體改變比較大，功率可以到400－600w，破碎5s，停5s，冰浴，要加終濃度1 mM的PMSF。為確定合適的超聲強度和次數，有必要隨時鏡檢觀察菌體是否完全破碎。

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