顯微攝影操作注意事項

1.攝影者對顯微攝影裝置的調整：包括兩目鏡瞳孔間距的調整和個人屈光不正的校正。前者指將兩目鏡的距離按個人的瞳孔間距進行調整，拉動目鏡或撚轉瞳孔間距調節螺旋。校正屈光時應轉動目鏡筒上的屈光度調節環，使物鏡視野中心的“十”字由單線調成雙線，達到完全清晰，並且左右眼應分彆調整。每個拍攝者都不宜省略這一步。顯微攝影操作注意事項。

2.物鏡與攝相目鏡不同組合的選擇：攝影目鏡除放大功能外，並不具備空間分辨功能，隻有物鏡才具有空間分辨力。在一般條件下，對組織切片厚度在20 μm以下者，應儘量選擇較高倍物鏡，例如欲放大實物50倍時，選擇“20×”物鏡配以“2.5×”目鏡的組合方式，其清晰度比“10×”物鏡及“5×”目鏡的組合方式要高些。但是也要考慮切片薄厚和觀察標本的特異性的問題，例如在厚度為30 μm以上的冰凍切片上，觀察蜿蜒走行的神經纖維或血管時，由於較低倍物鏡的焦點深度較長，有利於從不同深度、層次或角度，連續觀察分析不在同一平麵上走行的神經或血管影像。在這種情況下，還可將物鏡與目鏡不同組合多次拍攝，*終擇其效果*佳者。

3.聚光器的調控使用問題：經驗較少的攝影者往往缺少對聚光器高度的調節，也不知光源是否偏離視野中心。不少人隻進行了物鏡與組織切片間的所謂“上聚焦”，而冇有進行聚光器與組織切片間的“下聚焦”，這當然也無法獲得*佳清晰度的成像底片。Kohler照明法操做步驟如下：①將視場光闌縮至*小，使光闌葉片的通孔呈現其八角形影像；②兩手分彆撚轉載片台下的左右定心螺絲，使光闌影像與視場中心圓圈重合，以校正光路；③調節聚光器高度，使八角形光闌影像由模糊變清晰，即“下聚焦”；④散大該光闌至135幀幅邊框（指常規135型負片畫幅，24 mm×36 mm）影像外周。再次微調聚光器高度，使光闌象*清晰為止。每變換一次放大倍率時，都要重複進行如上調整步驟。

4.提高攝影反差：組織結構對比反差的好壞，當然取決於組織製備技術的質量。這是提高顯微攝影質量的重要環節。但是一般情況下，為了彌補切片中對比反差的不足，常可采用如下的補救措施：①按照物鏡上的數值孔徑值即NA值，相應地進行聚光器孔徑光闌的匹配調節。一般質量*良的物鏡鏡頭上，除標有放大倍率外，同時還標有NA值，NA值越大者空間分辨率相對越高。②如果按此法調節NA值轉盤後，若由於組織製備欠佳致使影像反差仍然不足時，則可將物鏡孔徑光闌的NA值再適當縮小，例如10x物鏡可調至0.19等。③如經過上述措施影像反差仍不好，則可將視場光闌從135（指常規135照片畫幅24 mm×36mm）邊框外縮至邊框內，然後在暗室擴放時，再將視場光闌影像除去。當然，上述的後兩種措施，隻不過是一種稍作修正的補救辦法而已。

5.低倍攝影難度大：低倍攝影有其特殊*點，例如在1（物）×2.5（目）放大倍率下，可拍攝大鼠腦切片一側全貌，對總覽特異性標記物的分布有一目了然之效果，但是低倍物鏡分辨力低，焦深較長，利用微調螺旋進行**聚焦有一定難度。為避免視力的個體差異,應采取欠焦、過焦、正焦3步,聚焦不宜反複進行。

6.油浸鏡頭的使用：100×的物鏡多為油浸鏡頭，然而，使用後常因鏡頭擦不淨而使鏡頭受損。替代的辦法是滴加超純水或雙蒸水，觀察效果與香柏油差彆不大。由於100×物鏡鏡頭與切片距離極近，極易碰損鏡頭，必須先以40×物鏡聚焦，再轉至100×物鏡，輕輕轉動聚焦微調螺旋至焦點。為避免鏡頭損傷，新型100×物鏡常有彈簧裝置，可使鏡頭微動伸縮而避免其損傷。

7.其它注意事項: ①按照常規,彩色膠卷應加LBD（色溫變換）濾片,黑白膠卷應加IF550（綠色）濾片。LBD濾片可使日光型彩卷獲得*佳色溫補償，IF550濾片則可使黑白卷分光感度與人眼者接近。儘管有人認為不一定需要濾光處理，但因為攝影取決於膠片的化學感光度，並不取決於人們眼睛對視野的直觀感受，還是加濾光片為好。②曝光時間的選定，也是一個必需注意的問題。已知在光強與曝光時間兩個參數之間，有許多不同的組合，均在曝光的“**”範圍內，但所謂的“**”範圍，並不等於*佳條件，所以作者認為限定曝光時間還是十分必要的，其道理在於膠卷化學感光度有一定限製，一個膠卷36個幀幅若隨意變動曝光時間，在36張之間差異將很大，而衝洗膠卷是在同一條件下，難免有些幀幅顯影不佳。依據作者的經驗，曝光時間一般限定在0.5～1s，底片的影像效果較佳。③要將重點拍攝的結構置於視場中心，因為自動曝光裝置測得的曝光時間，是以視場中心區為標準，而偏離中心區越遠越不準。有時為了兼顧結構局解關係，而重點結構又不在視場中心時，則可采取點（spot）曝光法。④若需將一張切片上的結構拍為幾張,之後拚接時,可在New Vanox 顯微攝影儀器上設有一個鎖定鍵（lock），有利於解決這一問題，以使同一結構的幾個幀幅曝光時間一致，然後在洗照片時將這組照片同時放入顯影液與定影液。

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