PCR擴增儀的常見問題

PCR擴增儀的常見問題

一、冇有擴增產物 1、循環溫度：變性溫度、退火溫度 2、引物設計 3、DNA聚合酶活性 4、抑製性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑製聚合酶活性的成份) 5、DNA樣品

二、非特異產物及電泳呈塗布狀 1、Mg2+濃度 2、調整引物、模板、聚合酶的用量3、適當減少循環數4、適當提高退火溫度，縮短退火或延伸時間?

三、引物二聚體的形成 1、檢查引物的序列 2、提高退火溫度 3、調整引物與模板濃度4、增加引物長度四、假陽性結果的預防 1、實驗器材應一次性使用(吸咀、PCR管) 2、注意操作環境，戴一次性手套 3、嚴格PCR操作規程 4、多次取樣的試劑應分裝 5、設置陰性對照和陽性對照 PCR

相關技術

一、錨定PCR(anchoredPCR)：引進錨定引物，可以幫助克服序列未知或序列未全知的障礙。在DNA3’-末端加上poly(dG)尾，與此相對應的錨定引物poly(dC)一般應在十二聚以上。

二、稱PCR(asymmetric PCR)不對稱PCR主要是在PCR體係中設計不同的引物濃度，兩條引物濃度比為1：50或1：100，前12個循環兩條模板等量擴增，之後低濃度引物消耗殆儘，其擴增產物減少以至於無；而高濃度引物介導產生的擴增產物（即單鏈DNA）逐漸增加，可得到大量單鏈DNA（ssDNA）用於直接測序。

三、反向PCR(inverse PCR)

四、多重PCR(multiplex PCR) 多重PCR是用多對引物同時對模板DNA上的多個區域進行擴增。多重PCR技術的難點不是在於其原理和操作的複雜性，而是在於其多對引物的設計，必需**多對引物之間不形成引物二聚體，引物與目標模板區域具有高度特異性。應用於基因診斷，對與**相關的基因（龐大）進行擴增檢測。

五、逆轉錄PCR(reverse?transcription?PCR,RT-PCR) 由mRNA逆轉錄產生cDNA鏈作為PCR反應模板。逆轉錄合成cDNA時，引物可選用特異引物、隨機六聚體引物或寡聚dT(12-18)。設計RT-PCR的引物時*好是分散在不同的外顯子上，以免基因組DNA的汙染導致假陽性結果。

六、差彆PCR(differential PCR) 差彆PCR是將靶基因與已知拷貝的參照基因置於同一PCR反應體係中，用同一套引物進行擴增，電泳染色後可根據參照基因的擴增產物與待測基因擴增產物的相對豐度對待測基因進行定量。

七、原位PCR(In situ PCR) 原位PCR是指在組織或細胞標本片上直接進行PCR，對細胞中的靶DNA進行擴增，通過摻入標記基團直接顯色或結合原位雜交進行檢測的方法。可分為直接法和間接法。基本步驟：組織切片或細胞固定→蛋白酶消化→原位PCR擴增→衝洗→產物檢測*點：靈敏度高，可進行細胞內定位。

八、熒光定量PCR(FQ-PCR) 熒光定量PCR：融彙PCR技術、DNA探針雜交技術(標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團)，結合**的光譜檢測技術發展起來的一項新技術。主要原理是在待擴增區域結合上DNA探針，PCR過程中，具有5’→3’外切酶活性的Taq酶延伸引物鏈到DNA探針時，將DNA探針逐個降解，釋放出熒光報告基團，這樣PCR體係中熒光的強度與PCR產物量之間存在正比關係，可通過測定熒光強度而對PCR產物定量。

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